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1.基本信息
(1)品系名稱：NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Vst/Vst
(2)常用名：NPG小鼠
(3)背景：NOD
(4)毛色：白色
(5) 品系建立：NPG小鼠，是北京維通達生物技術有限公司自主研發的一系列高度免疫缺陷大小鼠模型之一，將獲得的Il2rg基因敲除小鼠，回交到NOD-scid背景建立的高度免疫缺陷模型。使用該小鼠模型已經發表了一系列高水平研究論文[1~12]。
2.制作簡介
首先構建了Il2rg基因打靶載體，在B6/129 F1背景的ES細胞上，篩選得到將Il2rg基因敲除的陽性打靶細胞（見圖1）。通過囊胚注射的方法，獲得了Il2rg基因敲除的ES嵌合小鼠。然后，將ES打靶小鼠，與NOD-scid小鼠回交，從后代中選擇Il2rg因基敲除鼠，再與NOD-scid小鼠回交。通過12代的回交，獲得并選擇Il2rg-雄鼠和Il2rg+/-雌鼠交配，獲得PrkdcscidIl2rg-/-小鼠。隨后，NOD.PrkdcscidIl2rg-/- 小鼠按照近交系的方式擴繁生產。
圖1. Il2rg 基因打靶策略示意圖
3.質控檢測和表型分析
NPG小鼠主要包括兩個基因突變，（1）Prkdc基因的點突變，在84號外顯子上，TAT→TAA，產生了一個無效的包含83AA的刪短蛋白；（2）Il2rg基因小鼠，3-8外顯子的編碼區被刪除。NPG小鼠的SNP分析結果見表1，與NOD-scid (NOD.CB17- Prkdcscid/NcrCrlVr)小鼠一致。
表1. NPG 和NOD-scid 小鼠SNP分析結果。
SNP ID | Chr-cM | Allele | NPG | NOD-scid | |
1 | RS8253473-SNP1 | 1-80 | V=A, F=C | F F | F F |
2 | RS13476104-SNP1 | 1-128 | V=C, F=T | V V | V V |
3 | RS13476435-SNP1 | 2-35 | V=A, F=T | F F | F F |
4 | RS13476730-SNP1 | 2-119 | V=A, F=T | V V | V V |
5 | RS13477470-SNP1 | 3-146 | V=A, F=G | V V | V V |
6 | RS13478001-SNP1 | 4-135 | V=C, F=T | V V | V V |
7 | RS13478215-SNP1 | 5-42 | V=A, F=C | F F | F F |
8 | RS13459087-SNP1 | 5-86 | V=A, F=G | F F | F F |
9 | RS13478818-SNP1 | 6-73 | V=C, F=G | F F | F F |
10 | RS3710839-SNP1 | 6-121 | V=A, F=G | V V | V V |
11 | RS3666902-SNP1 | 7-15 | V=T, F=C | VV | VV |
12 | RS8260975-SNP1 | 7-34 | V=A, F=C | V V | V V |
13 | RS13479791-SNP1 | 8-60 | V=A, F=G | F F | F F |
14 | RS4227276-SNP1 | 8-80 | V=C, F=T | F F | F F |
15 | RS8254841-SNP1 | 9-38 | V=A, F=T | F F | F F |
16 | RS13480385-SNP1 | 9-103 | V=C, F=T | V V | V V |
17 | RS13480546-SNP1 | 10-24 | V=C, F=T | F F | F F |
18 | RS13480803-SNP1 | 10-123 | V=C, F=T | V V | V V |
19 | RS13480933-SNP1 | 11-25 | V=C, F=G | V V | V V |
20 | RS3653651-SNP1 | 11-102 | V=C, F=T | F F | F F |
21 | RS13481624-SNP1 | 12-99 | V=C, F=G | F F | F F |
22 | RS13481852-SNP1 | 13-63 | V=A, F=C | V V | V V |
23 | RS13482131-SNP1 | 14-30 | V=C, F=T | V V | V V |
24 | RS13459176-SNP1 | 15-3 | V=A, F=C | V V | V V |
25 | RS4170048-SNP1 | 16-32 | V=C, F=G | V V | V V |
26 | RS13482843-SNP1 | 17-4 | V=C, F=T | V V | V V |
27 | RS13483295-SNP1 | 18-35 | V=G, F=T | V V | V V |
28 | RS13483601-SNP1 | 19-34 | V=A, F=G | F F | F F |
29 | RS13483739-SNP1 | X-40 | V=C, F=T | V V | V V |
30 | RS13483962-SNP1 | X-109 | V=A, F=C | F F | F F |
NOD(non-obese diabetes) 背景適宜人源細胞移植[13]；Prkdc基因突變，小鼠T、B細胞缺失[14,15]；Il2rg蛋白的gamma鏈被敲除，其NK細胞活力幾乎喪失[16,17]。因而其基因檢測和表型分析主要集中在4個方面：①NOD背景（SNP檢測）；②Prkdc點突變（PCR檢測；T、B細胞缺失的流式檢測）；③Il2rg敲除（PCR檢測，功能性NK細胞缺失的流式檢測）；④細胞移植重建分析。
(1) NOD背景檢測
NPG小鼠制作使用的NOD-scid小鼠，其遺傳檢測數據見右上30個SNP(single nucleotide polymorphism)位點信息表，這些位點遺傳標記分布于20條染色體。
(2) Prkdc點突變、Il2rg敲除和NOD背景（Sirpa基因）檢測
Prkdc點突變小鼠， 1983年由?？怂共趟拱┌Y中心（Fox Chase Cancer Centre）的Bosma等人發現[14,15]。Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突變，小鼠的T和B細胞缺失 ，表現為細胞免疫和體液免疫的重度聯合免疫缺陷（severe combined immune deficiency, scid）。Il2rg敲除小鼠表現為胸腺發育不全，NK細胞數量減少，活性喪失[16,17]。目前Prkdc點突變常用的檢測方法為PCR檢測；蛋白水平的檢測比較方便的是流式分析其外周血中T、B淋巴細胞的含量。Il2rg敲除常用的檢測方法為PCR檢測；蛋白水平的檢測比較方便的是流式分析其脾臟中NK細胞的含量和活性。NPG小鼠采用上述方法進行質控，結果見下圖。
圖2 Prkdc基因PCR檢測 圖3 Il2rg基因PCR檢測
圖4 NOD背景（Sirpa基因）檢測
(3) T、B和NK細胞檢測
圖5 NPG小鼠缺失有功能的T、B和NK細胞。流式分析B6, Balb/c nude和NPG小鼠外周血中CD3+ CD4+ or CD3+CD8+ T 細胞 , B220+ B 細胞和NKp46+ NK 細胞的含量。
(4) 造血干細胞移植重建和腫瘤細胞移植數據
① NPG小鼠移植人造血干細胞效果顯著優于NOD-scid小鼠。
圖6 NPG和NOD-scid小鼠移植人造血干細胞，第12周時人CD45+細胞嵌合率分析。左圖為移植后12周時外周血中人CD45+細胞比例的流式分析結果；右圖為骨髓中人CD45+細胞的比例。
②人造血干細胞（HSCs）移植NPG小鼠高水平重建造血系統
圖7 NPG小鼠移植人造血干細胞（HSCs）后，可以高水平重建造血系統。左圖為將 5×104臍帶血CD34+細胞通過骨髓移植入6-8周的NPG小鼠后檢測結果; 右圖為1×105臍帶血CD34+細胞移植后16周在NPG小鼠脾臟中檢測到高水平的人CD45+細胞
③人造血干細胞（HSCs）移植NPG小鼠后重建各系造血細胞比例檢測
圖8人造血干細胞（HSCs）移植NPG小鼠后獲得各系造血細胞分化的高水平重建。上圖顯示的為將5×104臍帶血CD34+細胞移植16周后，在NPG小鼠外周血中檢測到高水平的人CD45+細胞（46.54%）、CD19+ B細胞（70.9%）、CD3+ T細胞（17.33%）和CD33+髓系細胞（8%）。
圖9 人造血干細胞（HSCs）移植NPG小鼠后各系細胞重建。臍帶血CD34+細胞移植NPG小鼠12周以及更長時間之后，人源造血細胞穩定重建，T細胞所占比例逐漸升高。
④NPG小鼠腫瘤免疫治療的相關研究
圖10 人腫瘤細胞移植NPG小鼠后更容易成瘤。上圖為使用NPG小鼠和BALB/c裸鼠，皮下接種人黑色素瘤細胞A375SM后，活體成像的腫瘤示蹤圖，可見NPG小鼠成瘤，與裸鼠相比，大小更均勻，生長到一定體積需要的時間相對更短。
4. 應用領域
（1）人源細胞或組織移植
（2）腫瘤和腫瘤干細胞研究
（3）ES和iPS細胞研究
（4）造血和免疫學研究
（5）人類疾病感染模型研究
（6）人源化動物模型研發
5. 參考文獻
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